Project Progress

Rezumat Etapa 1
Au fost sintetizati 6 polimeri PiPOx de diferite mase moleculare prin polimerizare anionica, folosind protocolul deja raportat de grupul nostru. Polimerii au fost caracterizati prin
spectroscopie de RMN de proton pentru a determina structura chimica si prin cromatografie de excluziune sterica (SEC) pentru a determina masa moleculara si distributia. Polimerii au fost trimisi la partener pentru studii de citotoxicitate.

Activitate 1.1 Dezvoltarea sintetica a precursorului pentru legarea DOX a fost realizata.

Rezumat Etapa 2
S-a investigat stabilitatea PiPOx in diverse medii apoase. Astfel, s-a constatat ca PiPOx este stabil in apa timp de doua luni, prezinta stabilitate buna in mediu bazic (de la 2 pana la 3
saptamani), prezinta stabilitate moderata in conditii neutre (5 zile) si are o stabilitate slaba in conditii acide (de ordinul a cateva ore) pana la debutul unui proces de degradare a
inelului oxazilinic.
In contextul aplicatiilor biomedicale, PiPOx a fost investigat si in medii simulate ale corpului, cum ar fi: fluid corporal simulat (SBF si PBS), saliva simulata (SSa), fluid intestinal
simulat (SIF), plasma si fluid gastric simulat (SGF). In toate aceste fluide simulate cu un pH cuprins intre 6.4 si 7.4 PiPOx prezinta o stabilitate chimica constanta de 5 zile, cu
exceptia SGF (pH 1.2). La pH 1,2, unitatile de iPOx din catena laterala sunt transformate intr-o structura de tip poli(N-(2-hidroxietil)metacrilamida solubila in apa pe parcursul a 2
saptamani de incubare la 37 °C.
Testele de degradare ale PiPOx in medii apoase simple si fluide corporale simulate au fost efectuate pentru a determina performanta acestui polimer in dezvoltarea de conjugate
polimerice, pentru aplicatii injectabile. Intervalul de stabilitate in aceste fluide corporale demonstreaza potentialul polimerului PiPOx de a fi utilizat in dezvoltarea sistemelor de livrare a
medicamentelor, inclusiv pentru administrarea intravenoasa a medicamentelor.
Conjugatele polimerice cu doxorubicina (DOX) au fost sintetizate cu succes prin reactii de post-modificare ale PiPOx. Astfel in prima etapa s-a modificat PiPOx cu 2-mercaptopropionat de etil.
In cea de-a doua etapa a avut loc hidrazinoliza gruparilor esterice urmata de reactia cu DOX. Intermediarii de reactie si compusii finali au fost caracterizati prin spectroscopie FTIR, H-RMN si UV-Vis. Interactia conjugatele polimerice obtinute cu celule tumorale urmeaza sa fie studiata in etapa urmatoare.

Partener 1

Polimerii PiPOx prezinta o viabilitate celulara relativa de peste 70% pe celule fibroblaste murine L929, la concentratii pana la 40 mg/mL, indicand non-citotoxicitatea materialelor.
Citokinele proinflamatorii TNF-alfa au prezentat concentratii similare intre PiPOx55 si PEG de masa moleculara mica si mare (3,35kDa si respectiv 35 kDa), dupa stimularea celulelor
macrofage RAW267.4. Citokinele proinflamatorii IL-6 au prezentat concentratii semnificativ mai mari in cazul stimularii cu PEG, comparativ cu PiPOx55 dupa stimularea celulelor macrofage RAW267.4

Activitate 2.1 Dezvoltarea sintetica a precursorilor si a polimerilor (PiPOx) a fost efectuata.
Activitate 2.2 Dezvoltarea sintetica a conjugatelor de PiPOx-DOX este in curs de perfectionare.
Activitate 2.3 Testarea in vitro a stabilitatii, a eliberarii de medicament si studii de citotoxicitate a materialelor au fost efectuate.
Activitate 2.4 Studii de interactie a conjugatelor PiPOx-DOX cu celule tumorale afla in derulare.
Activitate 2.5 Inducerea ICD se afla in derulare.
Activitate 2.6 Diseminare si participare la manifestari tehnico-stiintifice efectuata cu succes.

Rezumat Etapa 3/2022

In cadrul echipei coordonatorului au fost optimizate protocoalele de obtinere a conjugatelor de PiPOx-DOX. Continutul de doxorubicina a fost optimizat astfel incât sa se obtina conjugate polimerice solubile in apa. Conjugatele polimerice cât si intermediarii obtinuti au fost purificati si caracterizati prin spectroscopie FTIR, H-RMN si UV-Vis. S-au efectuat studii de reproductibilitate pentru verificarea corectitudinii rezultatelor si de ridicare la scara a sintezelor pentru avansarea de esantioane de polimeri PiPOx si conjugate PiPOx-DOX catre Partenerul 1 pentru testarea stabilitatii hidrolitice, a citotoxicitatii, hemocompatibilitatii, biodistributiei, a interactiei cu celulele tumorale si a inducerii de moarte celulara.

Partener 1

In aceasta etapa a fost investigata hemocompatibilitatea derivatilor polimerici. In acest scop, hemoliza si gradul de aglomerare al eritrocitelor au fost determinate pentru o serie de polimeri folosind tehnici binecunoscute pentru a obtine plasma-bogata-in trombocite (PRP).
De asemenea s-a efectuat o analiza a procesului de absorbtie si acumulare intracelulara a conjugatelor de PiPOx-DOX asupra celulelor tumorale, pentru determinarea parametrilor optimi. Experimentele de distributie intracelulara a conjugatelor si DOX libera au ajutat in stabilirea parametriilor de achizitie.
Evaluarea in timp real a acumularii celulare a conjugatelor PiPOx-DOX si a eliberarii de DOX indusa de variatii ale pH-ului a fost efectuata prin achizitionarea de imagini la fiecare 30 de minute in câte 4 pozitii pe o perioada de 72 ore pentru fiecare conditie experimentala, atât in contrast de faza, pentru observarea morfologiei celulare, cât si in epifluorescenta pentru monitorizarea doxorubicinei acumulate.
S-a investigat capacitatea DOX libera de a induce secretia/expunerea la suprafata a unora dintre semnalele de pericol asociate mortii celulare imunogene, HSP70 si calreticulina, in linia celulara de limfoblaste T umane Jurkat. Concentratiile de DOX libera utilizate pentru a evalua moartea imunogena au fost stabilite in experimentele preliminare realizate in etapa 2. Astfel, au fost selectate cele mai mici concentratii care, in urma tratamentului de 72 de ore, au determinat scaderea cu minim 50% a viabilitatii celulelor tumorale Jurkat.
Protocolul elaborat anterior a fost utilizat pentru a evalua capacitatea DOX eliberata din conjugatele polimerice PiPOx-DOX de a induce ICD. Celulele tratate cu PiPOx neconjugat au fost utilizate drept control negativ. Tratamentul celulelor Jurkat cu conjugat PiPOx-DOX a indus cresterea semnificativa a procentului de celule apoptotice care exprima calreticulina la suprafata, precum si a secretiei de HSP70 dupa 48 de ore de tratament, similar tratamentului cu DOX libera ceea ce indica faptul ca DOX eliberata din conjugatele polimerice poate induce moartea imunogena a celulelor tumorale dar cu o cinetica diferita de internalizare si eliberare intracelulara comparativ cu DOX libera.

Activitatea 3.1. Dezvoltarea sintetica a conjugatelor de PiPOx-DOX a fost perfectionata.
Activitatea 3.2. Testarea in vitro a stabilitatii, a eliberarii de medicament si studii de citotoxicitate a materialelor au fost investigate.
Activitatea 3.3. Studii de interactie a conjugatelor PiPOx-DOX cu celule tumorale au fost investigate.
Activitatea 3.4. Inducerea ICD a fost investigata.
Activitatea 3.5. Diseminarea pe scara larga prin comunicarea si publicarea nationala sau internationala a rezultatelor efectuata cu succes.

Prezentare succinta a produsului dezvoltat

In cadrul proiectului experimental demonstrativ a fost dezvoltata o platforma inovativa de conjugate polimerice pentru tratamentul tumorilor, pe baza de (2-izopropenil-2-oxazolina) (PiPOx) si doxorubicina (DOX) ca agent chemo-imuno terapeutic, concept validat la nivel de laborator supus brevetarii.
Prin intermediul obiectivelor si activitatilor desfasurate in cadrul proiectului experimental demostrativ, echipa multidisciplinara de specialisti a reusit sa demonstreze versatilitatea si superioritatea conjugatelor de PiPOx-DOX ca sistem avansat de eliberare controlata a DOX la locul tumorii.
Modelul de conjugat polimeric dezvoltat aici a aratat o imbunatatire a activitatii imune antitumorale si inducere de moarte celulara, totodata având o citotoxicitatea sistemica redusa fata de DOX libera.
Aceste model de conjugate polimerice ar putea ameliora sau chiar combate unele dezavantaje pe care le prezinta chimio-terapia in prezent, cum ar fi rezistenta la tratament, dozaj mare de medicament si efecte adverse inerente.